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qPCR 和 dPCR 區(qū)別,以及各自的最佳應(yīng)用

PCR 擴(kuò)增 DNA 是實(shí)驗(yàn)室中常用的基礎(chǔ)技術(shù),隨著技術(shù)的發(fā)展,其應(yīng)用范圍不斷擴(kuò)展,包括臨床檢測。定量 PCR (qPCR) 是一種可靠的已建立的方法,允許對靶 DNA 進(jìn)行相對定量,例如基于 PCR 的冠狀病毒測試使用 qPCR。相比之下,數(shù)字 PCR (dPCR) 或液滴數(shù)字 PCR (ddPCR) 使用類似的化學(xué)方法檢測 DNA 序列,但在許多微小體積或液滴中進(jìn)行檢測,利用數(shù)學(xué)的力量提高信噪比。


雖然 qPCR 和 dPCR 有很多相似之處和不同之處,但在與 PCR 專家交談時(shí),有幾個(gè)重要的品質(zhì)更加突出。隨著時(shí)間的推移,PCR 技術(shù)在不斷發(fā)展,因此這些品質(zhì)也可能會(huì)隨之改變。本文旨在討論當(dāng)今 qPCR 和 dPCR 技術(shù)之間的一些重要區(qū)別,以及它們在不同領(lǐng)域的最佳應(yīng)用。


01

靈敏度,以及絕對與相對定量


多年來,定量 PCR 一直是許多應(yīng)用的黃金標(biāo)準(zhǔn)。然而,dPCR 能夠提供更靈敏的測量和目標(biāo) DNA 的絕對定量(相對于 qPCR 的相對定量)。"使用 qPCR,科學(xué)家只能通過將結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較來確定樣本中的核酸濃度,"生物制藥部門經(jīng)理 Marwan Alsarraj 解釋道。"另一方面,ddPCR 直接量化核酸,因此對小核酸濃度更敏感,使工具更準(zhǔn)確。"


這使得 dPCR 非常適合于目標(biāo)存在于復(fù)雜樣本中的應(yīng)用,例如分析來自液體活檢的循環(huán)腫瘤 DNA。"隨著目標(biāo)分子變得越來越少,檢測和精確量化這些分子變得越來越具有挑戰(zhàn)性," dPCR 高級(jí)總監(jiān)兼總經(jīng)理 Paul Hung 說道。"由于 dPCR 自然稀釋了許多反應(yīng)中的分子,因此當(dāng)給定目標(biāo)存在于高濃度的非目標(biāo)分子中時(shí),可以提高靈敏度。"盡管如此,qPCR 仍然是許多應(yīng)用的首選方法,因?yàn)槠渌俣雀?,更易于使用,并且可以在更大的樣本集中進(jìn)行相對定量。

02

在實(shí)驗(yàn)室和診所中越來越多地使用 dPCR


dPCR 的靈敏度提高使得研究實(shí)驗(yàn)室和診所都受益?!半S著細(xì)胞和基因治療研究和開發(fā)的不斷發(fā)展,開發(fā)人員越來越多地轉(zhuǎn)向 dPCR 來精確測量不同的目標(biāo),包括工程病毒載體、基因編輯事件、質(zhì)粒和完整衣殼,”Paul Hung 表示。


在臨床領(lǐng)域,如腫瘤學(xué)和器官移植等方面,dPCR 檢測稀有 DNA 的能力以及量化稀有 DNA 中微小但有顯著的倍數(shù)變化,也受到了青睞。例如,dPCR 被用于檢測癌癥患者的循環(huán)腫瘤 DNA,并評(píng)估細(xì)胞和基因治療的正確劑量?!半S著精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)變得越來越主流,我們預(yù)計(jì) ddPCR 將在臨床中變得更加普遍,因?yàn)?ddPCR 可以檢測腫瘤負(fù)荷響應(yīng)癌癥治療的微小變化,”Marwan Alsarraj 表示?!袄纾褂?ddPCR 進(jìn)行連續(xù)監(jiān)測可以使腫瘤學(xué)家識(shí)別治療后有復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的患者?!比欢?,在某些情況下,qPCR仍然是臨床應(yīng)用的首選方法,因?yàn)樗焖?,更易于使用,并且可以在更大的樣本集中進(jìn)行相對定量。


03

動(dòng)態(tài)范圍和靈活性


盡管 dPCR 在靈敏度方面表現(xiàn)出色,但在許多其他應(yīng)用中,qPCR 仍然是最佳選擇。"我們建議我們的客戶在基因表達(dá)中使用 qPCR,因?yàn)樗膭?dòng)態(tài)范圍很廣;其量化不同表達(dá)水平、區(qū)分剪接變體和多重分析的能力;及其高通量應(yīng)用和自動(dòng)化的能力," Marwan Alsarraj 表示。實(shí)際上,在實(shí)驗(yàn)室和監(jiān)管環(huán)境中,qPCR 更為廣泛應(yīng)用,并且被廣泛用于基因、健康狀況或傳染病的篩查。


在分析大量樣本時(shí),qPCR 可能比 dPCR 更為經(jīng)濟(jì)實(shí)惠。"qPCR 本質(zhì)上是一種靈活且具有成本效益的技術(shù),可滿足許多研究需求,使研究人員能夠選擇適合其特定需求的耗材,包括多種反應(yīng)化學(xué)、分析選項(xiàng)和易于互換的塑料," Paul Hung 表示。"在生物制藥行業(yè),qPCR 被用于單克隆抗體、疫苗、細(xì)胞和基因治療以及生物仿制藥的制造過程中,作為質(zhì)量控制和基因分析的工具。"


隨著不斷的創(chuàng)新和廣泛的使用,qPCR 的應(yīng)用只會(huì)擴(kuò)大。"科學(xué)家們不斷發(fā)現(xiàn)使用 qPCR 的新方法,因?yàn)樗呀?jīng)從基因表達(dá)擴(kuò)展到制造和診斷的過程測試,"Alsarraj 表示。"我們希望隨著技術(shù)核心應(yīng)用的成熟,創(chuàng)新將繼續(xù)下去。"


04

多重應(yīng)用的進(jìn)展

盡管 qPCR 曾經(jīng)在多重檢測方面具有優(yōu)勢,但數(shù)字 PCR(dPCR)正在迅速成為發(fā)展更高的多重檢測功能的平臺(tái)。例如,Stilla Technologies 的 naica ®系統(tǒng)等平臺(tái)可以運(yùn)行 30 重或更多的 dPCR 反應(yīng)?!耙恍┛蛻艨梢栽?naica ®系統(tǒng)上運(yùn)行與在 qPCR 儀器上相同的分析,但他們只運(yùn)行一次樣品并獲得絕對定量,而不是依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線并不得不重復(fù)運(yùn)行他們的樣品,”Stilla Technologies 全球營銷和商業(yè)運(yùn)營副總裁 Matthew Grow 表示?!霸?naica ®系統(tǒng)為研究人員提供了查看擴(kuò)增和檢測效率的能力,一直到單個(gè)液滴的水平,每個(gè) PCR 反應(yīng)在他們珍貴的樣本中并行發(fā)生。”


隨著 dPCR 能夠檢測稀有基因表達(dá)或癌癥相關(guān)的拷貝數(shù)變異事件,更多的多路復(fù)用可能會(huì)揭示更多未來使用的途徑。“多重 dPCR 是對當(dāng)前下一代測序技術(shù)的出色補(bǔ)充,可以讓醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室有機(jī)會(huì)進(jìn)行更多的內(nèi)部患者檢測,而不必與外包或集中式實(shí)驗(yàn)室合作,”Matthew Grow 指出。


盡管如此,qPCR 和 dPCR 可能會(huì)繼續(xù)以互補(bǔ)關(guān)系存在。“我們已經(jīng)看到 qPCR 對于監(jiān)測和管理 COVID-19 大流行的重要性,它將仍然是臨床測試實(shí)驗(yàn)室、分析開發(fā)人員和生物技術(shù)行業(yè)的重要工具,”Paul Hung 表示。“隨著 dPCR 技術(shù)通過簡化的工作流程和更快的回答時(shí)間變得更容易獲得,它將在需要穩(wěn)健、可靠和精確量化的用例中得到采用。因此,兩種技術(shù)將繼續(xù)在不同的應(yīng)用場景中發(fā)揮各自的優(yōu)勢?!?
2023-9-8
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